Fortpflanzung und Technik in Frankreich
© Otmar Beyer de Béhaux
| Lang
ist es her, daß Hengste und Stuten ihre Liebesspiele in
der freien Natur darboten und der Bauer nach Monaten
bangen Wartens dann, ca 7 - 9 Monate später, endlich
wusste ob seine Stute trächtig ist oder nicht. Die meisten Rassen haben sich vollkommen dem Zuchtfortschritt untergeordnet und räumen der modernen Fortpflanzungstechnik einen grossen Spielraum ein. So sind Trächtigkeitskontrollen durch Echolot und Frisch- und Kühlspermabesamung keine weltbewegenden Akte mehr. Der Fortschritt der Tiermedizin erfolgt in grossen Schritten, jedoch nicht einheitlich auf der ganzen Welt. So sind die Forschungen was die Fortpflanzung der Pferde betrifft in den USA und Frankreich weiterfortgeschritten als in Deutschland. Besonders die franz. Wissenschaft gehört zu den besten der ganzen Welt und wird die am weitestenfortgeschrittene in Europa sein. Die Versuche in der Pferdefortpflanzung werden, falls sie erfolgreich zu Ende geführt werden können, in den nächsten 10 Jahren die Zucht revolutioneren. Da der technische Fortschritt nicht auf ein Land begrenzt werden kann, ist es für die Züchter interessant zu erfahren, wo konkrete Verbesserungen zu erwarten sind und wie sie sich auf die Pferdezucht auswirken. Teil I : Die Befruchtungstechniken Die künstliche Besamung (KB) Die ersten Versuche mit der künstlichen Befruchtung bei Pferden gehen, in Frankreich, bis in die 50iger Jahre zurück. Die erste nicht-experimentale Anwendung fand im Jahr 1980 statt. Heute schon decken mehr Hengste durch künstliche Besamung als im Natursprung. Sie unterscheidet sich von der Deckung im Natursprung durch mehrere Faktoren : 1. es findet kein direkter Kontakt zwischen Hengst und Stute statt, das heißt, das z.B. keine Bakterien und Viren, also Krankheitserreger übertragen werden ; 2. der Hengst wird durch die KB weniger stark beansprucht, was gleichbedeutend ist mit einer längeren Aktivität, da weniger Ermüdungserscheinungen ; 3. Sperma und Eizellen sind in direktem Kontakt bei der KB, was eine Verkleinerung der Portionen und damit eine Erhöhung der Stutenzahl bedeutet. Man unterscheidet die drei nachstehend beschriebenen Besamungen, bei denen fast nur der Konservationszeitraum und die Aufbereitung des Spermas variieren, die Absamungsmethode bleibt in allen Fällen die gleiche. Der Hengst samt in eine künstl. Scheide ab, an deren Ende das Sperma aufgefangen wird. Anschliessend wird es aufbereitet und portioniert. Mit einem Ejakulat können so mehrere Stuten besamt werden. Die Zahl der besambaren Stuten hängt dabei von der Spermakonzentration und -qualität ab. Die Ejakulatsmenge schwankt zwischen ca 25 und 100 ml. Frischsperma Frischsperma hat nur einen Konservationszeitraum von einigen Stunden. Die Stute wird direkt anschliessend besamt. Hengst und Stute sind nicht in direktem Kontakt, müssen jedoch am gleichen Ort stehen. Der Hengst muss jedoch bereitstehen und es ist schwierig ihn eine gleichzeitige Sportkarriere absolvieren zu lassen. Die Trächtigkeitsrate liegt bei ca 90%, was 15 - 20 Punkte über der Rate eines im Natursprung deckenden Hengstes liegt. Kühlsperma Die Kühlung des Sperma ermöglicht eine Besamung in einem Zeitraum von 12 - 36 Stunden. Hengst und Stute müssen nicht mehr am gleichen Ort stehen, man kann es sogar über grosse Strecken transportieren, wie es bei Galoubet der Fall ist, der in Amerika steht und in Frankreich durch Kühlsperma deckt. Im Gegensatz zum Frischsperma wird es auf knapp +4° C abgekühlt. Um einen Kühlschock zu vermeiden, wird das Sperma langsam, das heisst in ca 10 Stunden, abgekühlt. Es wird auch Milch und/oder Eigelb zugesetzt, die einen Schutz für die Spermatozoide darstellen. Der Lagerzeitraum ist noch relativ kurz. Erfolgreiche Versuche wurden durchgeführt, die eine Trächtigkeitsrate von ca 60% mit Sperma erreichten, welches 24 Stunden alt war. Andere Versuche, die jedoch nur die Spermamobilität betrafen, fanden noch genug befruchtungsfähige Spermatozoide nach 72 Stunden. Kühlsperma wird unter anderem bei den Hengsten verwendet, deren Sperma eine Gefrierung nicht zulässt, da die Anzahl der lebenden Spermatozoïden nach Auftauung ungenügend für eine erfolgreiche Besamung erscheint und bei den Hengsten, die den Mindestanforderungen im Leistungs- und Vererbungsindex nicht genügen. Die Trächtigkeitsraten bewegen sich in ähnlichen Zahlen wie bei der Frischspermabesamung. Gefriersperma Gefriersperma ist die Ideallösung für Hengste, die im gleichzeitigen Deck- und Sporteinsatz stehen. Die Absamung erfolgt meistens im Winter, da keine Turniere gegangen werden. Der Konservierungszeitraum des Gefrierspermas ist fast unbegrenzt. Seine Grenzen liegen jedoch bei der Spermaqualität, da nur knapp die Hälfte aller Hengste noch genug lebensfähige Spermatozoïden nach der Auftauung haben. 35% sind hier in Frankreich dieses notwendige Minimum. Es können nur Hengste in der KB durch Gefriersperma eingesetzt werden, die einen Mindestindex von 140 mit einer Wahrscheinlichkeit von mindestens 0,40 aufweisen. Das Stutenlimit ist in jedem Fall höchstens 100. Die Trächtigkeitsrate liegt tiefer als bei Frisch- und Kühlsperma : ca 70 - 75%. Dies entspricht in etwa der Erfolgsquote bei im Natursprung deckenden Hengsten. Die Technik ist recht einfach. Nach der Absamung wird das Sperma in einem Wasserbad von 35° C gefiltert und anschliessend verdünnt auf 1/40 der ursprünglichen Konzentration. Es schliesst sich eine Ruhepause an, der die Trennung von Spermaflüssigkeit und Lösung folgt. Diese Spermakonzentration wird wieder mit einer anderen Lösung verdünnt, der man einen Kryo-Schutz zufügt, der das Explodieren der Zelle bei der Auftauung verhindern soll. Die Konzentration muss bei 100 Millionen Spermatozoïden pro Milliliter liegen. Die Pailetten, das heisst Portionen, werden nach einer Ruhepause abgefüllt und tiefgefroren. Die Gefrierung, genau wie die Auftauung müssen dabei recht schnell erfolgen. Die Gefrierung erfolgt in ca 10 Minuten über flüssigem Stickstoff (Temperatur -160° C) bevor es in diesen zur Lagerung getaucht wird. Eine andere Methode ist die zwar schnelle, jedoch stufenweise Gefrierung. Die Auftauung erfolgt, je nach Methode, in weniger als einer Minute. Jedes Ejakulat unterliegt einem willkürlichem Test nach der Auftauung. Eine Pailette enthält 0,5 ml, 8 Pailetten bilden eine Besamungsportion und pro Stute sind insgesamt 32 Pailetten vorgesehen. Die Unterschiede in der Anwendung liegen weniger in den Manipulationen, die in der ganzen Welt gleich oder ähnlich sind, sondern viel mehr unterscheiden sich die Lösungen und die Pailettengrösse. Da die Technik gut beherrscht wird, wird der noch zu erzielende Fortschritt zur Erhöhung der Trächtigkeitsrate besonders bei der Lösung und dem Kryo-Schutz liegen. Die Reagenzglasbefruchtung Die Reagenzglasbefruchtung ist die Befruchtung einer, einer Stute entnommenen, Eizelle, durch das aufbereitet Sperma, was einem Hengst abgenommen wurde. Die Befruchtung findet ausserhalb des Körpers in einem Reagenzglas statt. Das franz. Team des INRA Nouzilly wahr das erste und wahrscheinlich bis heute einzig erfolgreiche. Die Geburt wurde für Juni 1990 erwartet und dann im Juli des gleichen Jahres auf dem 5. Internationalen Kongress zur Fortpflanzung vorgestellt. Die Abnahme der Eizelle ist technisch kein Problem und beruht auf einem Nicht-chirurgischen Eingriff, jedoch ist das Resultat äusserst schwach, da im Durchschnitt nur ca 0,6 Eizellen pro Stute geerntet werden. Andere Teams benutzen Schlachtstuten, um sich die benötigten Eizellen zu besorgen, jedoch muss in diesem Fall die Reifung auch künstlich erfolgen, was noch ein Problem darstellt. Erinnert werden muss hier an die Tatsache, daß die weiblichen Säugetiere nur einen begrenzten Vorrat von Eizellen haben. Wenn dieser Vorrat aufgebraucht ist, tritt die Menopause ein. Das Sperma muss nach der Absamung des Hengstes aufbereitet werden, da es in seinem natürlchen Zustand nicht in die Eizelle eindringen könnte. Die Eindringung erfolgt durch die Freisetzung von Enzymen. Diese letzte Reifung wird normalerweise durch ein Bebrüten bei ca 37° C erreicht. Gleichzeitig versuchte das INRA-Team ein neues Lösungsmittel, welches die Lebensdauer der Spermatozoïden erhöhte. Trotz dieser beiden Faktoren haben bei vielen von ihnen die notwendigen Reaktionen nicht stattgefunden. Die Zellaktivierung wurde durch Kalziumeintritt erreicht, welcher wiederum durch Ionophore A23187 erzwungen wurde. Nach diesen Behandlungen waren die Spermatozoïden penetrationsfähig ! Die Umgebungs- und Materialkonditionen wurden von der Humanmedizin abgeleitet. Die erste gelungene Befruchtung wurde am 5/10/1988 erreicht. Die Erfogsrate der folgenden Versuche ist jedoch noch recht mager, da nur in 23 von 113 Fällen ein Spermatozoïd in die Eizelle eindringen konnte (20%) ; nur in 16 Fällen (14%) konnte ein Beginn der Teilung, das heisst der Entwicklung, festgestellt werden. Der so erhaltene Embryo wird als Morula (5./6. Tag) verpflanzt. Die Mehrzahl der Versuche liessen den Embryo bis zu diesem Stadium in einer Nährkultur. In einigen Fällen wurde eine Verpflanzung nach nur 48 Stunden vorgenommen. Die Einpflanzung des Embryo erfolgt durch einen chirurgischen Eingriff, wie er auch in den USA praktiziert wird (siehe unten). Die drei ersten Einpflanzung wurden resorbiert, von den 8 weiteren eingepflanzten Stuten war nur eine nach 14 Tagen trächtig. Bei dieser Stute verlief die Trächtigkeit, den Kontrollen im 6. Monat nach zu urteilen, normal. Dieses erste Reagenzglasfohlen wurde im Jahr 1990 geboren. Ein zweites folgte 2 Jahre später.
Teil II : Die Foetaltechniken, die Fruchtbarkeitserhöhung und die Zellmanipulationen Der Embryonentransfer Die Versuche, Embryonen zu verpflanzen, wurden von der Veterinärmedizin vor fast 20 Jahren in verschiedenen Ländern in Angriff genommen. Die ersten erfolgreichen Transfere datieren aus aus dem Ende der 70iger Jahre. Der erste kommerzielle Versuch wurde 1985 von der INRA Nouzilly in Frankreich erfolgreich durchgeführt. 1988 wurde ein Labor zur kommerziellen Verpflanzung von Emrbyonen dem Nationalgestüt Montier-en-Der angegliedert. Damit kann man das Versuchsstadium als abgeschlossen bezeichnen. Die ersten Privatpersonen und Unternehmen praktizieren diese Technik 1989. Die Anzahl der gegebenen Autorisationen erhöht sich von 54 im Jahre 1990 auf 94 (1991) und 105 (1992). Anträge zur Erlaubnis eines Embryonentransfers werden fast ausschliesslich für SF-Stuten gestellt, da sie auch heute noch, genauso wie die KB für Vollblüter verboten ist ; das Traberstutbuch gibt nur höchst selten seine Erlaubnis für einen Transfer. Diese SF-Stuten kann man im Grossen in zwei Kategorien teilen : 1. junge Stuten, die gleichzeitig ein Sportkarriere verfolgen, 2. Stuten, die aus gesundheitlichen oder Altersgründen ein Fohlen nicht austragen könnten. Für beide Gruppen gilt, daß sie stark überdurchschnittliche Leistungs- (ISO) bzw Vererbungsindices haben (DSO, BSO). In Frankreich benutzen die 9 grössten Zentren die nicht-chirurgische Methode und das Material, welches von der IMV (Privatgesellschaft die auf die Herstellung und Distribution von Veterinärmaterial spezialisiert ist) hergestellt wird. Bei den nachfolgenden Ergebnissen ist zu beachten, daß es sich nur um Tendenzen handeln kann, da Verpflanzungen zwar perfekt beherrscht werden, die Anzahl jedoch noch vollkommen ungenügend ist um definitive Aussagen machen zu können. Die bei der Verpflanzung zu beachtenden Faktoren sind gegenseitig abhängig. Die drei wichtigsten sind : die Qualität des Eingriffes, die Absaugung und die Einpflanzung. 1992 wurden bei 102 Stuten Deckungen vorgenommen. 386 Absaugungen ergaben 191 Embryonen die verpflanzt wurden. Es wurden dabei 115 Trächtigkeiten erzielt. Von den 102 Stuten wurden 41 nicht trächtig, 31 wurden einmal, 21 zweimal und nur 9 dreimal trächtig. Die Erfolgsraten sind folgende : Embryonen pro Absaugung 51%, Trächtigkeit pro Verpflanzung 60%. Zu beachten ist dabei jedoch, daß die Erfolgsquoten vor allem für das Vorhandensein von Embryonen bei jungen Stuten ohne Fohlen bei Fuss höher als der Durchschnitt, für Problemstuten geringer als der Durchschnitt sind. Der ausschlaggebende Faktor eines Embryonentransfers ist die Synchronisation zwischen Geber- und Erhalterstute.
Als Alternative zur Synchronisation kann man auch Stuten verwenden, die keinen Fortpflanzungszyklus, bedingt durch Hormonprobleme oder Ovariektomie, haben . In diesem Fall muss die Stute während der kompletten Trächtigkeit mit Hormonen behandelt werden. Eine weitere Alternative, die aber auch noch im Versuchsstadium ist, sind die Gefrierembryonen. Die Versuche wurden in Analogie zu den Erfahrungen mit Rindern vorgenommen und es zeigt sich, daß auch bei Stuten die Idealkandidatin maiden ist, d.h. noch nie ein Fohlen gehabt hat. Die Versuche mit der Synchronisation zeigen, daß es möglich ist einen 7 Tageembryo einer Stute einzupflanzen, die zwischen dem 4 und dem 9 Tag des Zyklus ist ; die besten Ergebnisse wurden jedoch bei Stuten erzielt, die im 5. oder 6. Tag ihres Zyklus waren. Über die bessere Adaptation einer Rasse, man kann ein Reitpferdembryo einer Kaltblutsttute einpflanzen, kann, aus quantitativen Gründen, keine definitive Aussage gemacht werden, jedoch hat die Rasse der Erhalterstute Einfluss z.B. auf die Grösse und das Temperament, was durch Zwillingsversuche festgestellt worden ist. Da meistens der Kauf der Erhalterstute eine Bedingung ist, ist der Kostenpunkt eines Embryonentransfers noch recht hoch : zwischen 10.000 DM und 20.000 DM (Angaben zu 1989) Der Embryonentransfer wird durch zwei verschieden Methoden erzielt : chirurgische (USA, Grossbritannien, etc) oder nicht-chirurgische (nur Frankreich). Die Absaugung zur Ernte des Embryon ist allgemeingebräuchlich auf der ganzen Welt. Die Absaugung wird zwischen dem 6. und 8. Tag durch eine Waschung der Gebärmutter vorgenommen. Bevor er dann der Erhalterstute eingepflanzt wird, wird der Embryo vorbereitet. Die Franzosen benutzen zur Einpflanzung die natürlichen Geburtswege. Sofort nach der Vorbereitung des Embryo (Dekontamination), das heisst noch in der selben Stunde, wird er durch eine Sonde in den Uterus der Erhalterstute eingespritzt. Er schwimmt dabei in einer sterilen Lösung. Die Grösse variiert leicht, liegt jedoch bei ca 0,5 mm im Durchschnitt. Dabei muss die absolute Sterilität und Ungiftigkeit aller Instrumente beachtet werden. So ist z.B. die kleine Erfolgsquote der INRA 1988 auf eine Unverträglichkeit zwischen dem Embryo und dem verwendeten Material zurückzuführen, Bei dem chirurgischen Eingriff (USA) wird die Flanke der Stute unter Lokalanästhesie geöffnet, das Gebärmutterhorn wird an seinem äusseren Ende etwas herausgezogen und die Lösung, die den Embryo enthält, mit einer Nadel eingespritzt. Die Erfolge der franz. Forscher in Nouzilly :
Die Gefrierembryonen Gefrierembryonen haben den grossen Vorteil, auf die Synchronisation, das heisst Gleichschaltung, der Geber- und Erhalterstute verzichten zu können. Auch die Transportierbarkeit ist stark erhöht. Die Methode ist von der, die bei Rindern benutzt wird abgeleitet. Bei dieser Spezies kann ein Züchter nach Katalog den Embryo mit der Abstammmung, die ihm gefällt aussuchen, kaufen und einpflanzen lassen. Der erste erfolgreiche Gefrierembryo wurde 1982 von einem japanischem Team geboren. Seitdem sind mehr als 200 Einpflanzung von Gefrierembryonen versucht worden, jedoch liegt die Erfolgsrate bei weniger als 20%. Die heute gebräuchliche Methode sieht folgender Massen aus : Absaugung des Embryo im 6 Tag, Reinigung, langsame Abkühlung bzw Gefrierung des Embryo in 3 Stufen, Schockgefrierung, langsame Auftauung, Reinigung, Einpflanzung. Der noch zu erzielende Fortschritt wird auf einer Verbesserung der Kenntnisse bei Grösse und Alter des zu verpflanzenden Embryons und auf einer Verbesserung der Kryo-Schutze beruhen. Die Superovulation Der Nutzen der Superovulation liegt in der Vielzahl der benötigten Eizellen für die medizinischen Versuche, bei z.B. der Reagenzglasbefruchtung. Zur Zeit liegt das Mittel bei 0,6 Eizellen pro Stute. Eine Superovulation ist das Vorhandensein von mehreren befruchtbaren Eizellen (¢ Zwillingsgeburten). Selten bei der Stute, ist sie normal bei Rindern. Jedoch ist sie auch mit künstlichen Mitteln bei der Stute relativ schwer herbeizuführen. Das Problem liegt dabei weniger bei der Superovulation selbst, als bei der Nutzung der vorhandenen, befruchtbaren Eizellen. Die Fruchtbarkeit leidet stark unter der Superovulation und die Trächtigkeitsrate liegt nicht höher als bei einer normalen Ovulation. In der Experimentalstation der franz. Nationalgestüte liegt die normale Trächtigkeitsrate bei ca 60% pro Hitze. Diese Rate variiert leider nicht bei den zur Superovulation behandelten Stuten, obwohl diese dreimal mehr befruchtbare Eizellen produzieren. Die Versuche in dieser Richtung sind also noch nicht von Erfolg gekrönt. Embryonenteilungen Embryonenteilung sind in Frankreich schon erfolgreich vorgenommen worden. Man kann sie als künstlich erzeugte, eineiige Zwillinge bezeichnen. Die in dieser Richtung unternommenen Versuche dienen noch ausschliesslich der Wissenschaft. Mit diesen genetisch völlig identischen Versuchstieren werden die Einflüsse von Umwelt, Ernährung etc auf die Pferde untersucht. Ganz allgemein dienen Versuche mit Zwillingen, genetisch identischen Lebewesen also, dazu, die verschiedenen Einflüsse der Umwelt und des Menschen zu untersuchen. Genetisch identisch sind aber nur eineiige Zwillinge und Lebewesen, die aus einer Embryonenteilung hervorgegangen sind. Der Erfolg der Teilungen beruht auf dem Fehlen der Hülle, die sich in ca 8 Stunden nach Eintritt in die Gebärmutter bildet. War diese Hülle vorhanden, so waren alle Versuche negatif; fehlte die Hülle noch, so wurden recht gute Erfolge erzielt. Die Embryonengrösse spielt eine weniger grosse Rolle, jedoch werden die meisten Versuche bei einer Grösse von weniger als 10 Zellen unternommen. Clonage Ein Clone ist ein Lebewesen, das nur einen Elternteil besitzt und diesem genetisch völlig identisch ist. Die Versuche sind noch nicht sehr weit gediehen. Sein Nutzen liegt in der Duplizierung herausragender Pferde, die so weitergehend, bzw auf eine andere Art genutzt werden können, bzw über einen undefinierbaren Zeitraum hinaus erhalten werden können. Beachtet werden müssen die Umwelteinflüsse, die einen nicht zu unterschätzenden Einfluss auf das erwachsene Lebewesen haben. Geschlechtsbestimmung Da die Geschlechtsbestimmung bei Pferden keine wirtschaftliche Grösse besitzt, sind nie ernsthafte Versuche unternommen worden. Nur eine Arbeit behandelt dieses Thema, die jedoch eine Wahrscheinlichkeit der Geschlechtsbestimmung von 80% erreicht.
Bibliographie Analyse objective de la
mobilité de sperme congelé - décongelé. Essai de
corrélation avec la fertilité Dossier Vétérinaire :
L'insémination ... sans Etalon Dossier Vétérinaire :
Le Transfert d'Embryons Essais de Superovulation
chez la jument Fécondation in vitro
chez les Equidés Fécondations et
développement embryonnaire précoce chez la jument L'Embryon, "Cheval
de Bataille" de la Recherche Equine L'insémination
Artificielle chez les Equidés La jument
ovariéctomisée ou en anoestrus comme mère porteuse
d'embryons Le Transfert d'Embryons
- une technique qui se développe Mères par Procurations Premières fécondations
in vitro chez le cheval Rendez-vous Manqué Stars en Paillette Transplantation
Embryonnaire Equine |